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论著
大鼠严重烧伤后心肌组织溶酶体液泡型腺苷三磷酸酶活性变化对心肌损害的影响及其机制
中华烧伤杂志, 2017,33(05): 295-300. DOI: 10.3760/cma.j.issn.1009-2587.2017.05.008
摘要
目的

探讨大鼠严重烧伤后心肌组织溶酶体液泡型ATP(V-ATP)酶活性变化对心肌损害的影响及其机制。

方法

取12只SD大鼠心脏,采用超高速梯度密度离心法提取心肌组织溶酶体,蛋白质印迹法和透射电镜观察鉴定。将120只SD大鼠按随机数字表法分为单纯烧伤组、ATP组、正常对照组、巴佛洛霉素组,每组30只。单纯烧伤组和ATP组大鼠造成背部约40%TBSA Ⅲ度烫伤,单纯烧伤组大鼠伤后即刻腹腔注射乳酸林格液4 mL·%TBSA-1·kg-1,ATP组大鼠分别于伤前12 h、伤后即刻、伤后12 h腹腔注射ATP 0.4 mg/kg。正常对照组大鼠不行任何处理,巴佛洛霉素组与ATP组大鼠同时相点腹腔注射巴佛洛霉素A1 0.3 mg/kg。于伤后24 h,提取各组大鼠心肌组织溶酶体,采用酶偶联分析法检测V-ATP酶活性,蛋白质印迹法检测心肌自噬相关蛋白微管相关蛋白1轻链3(LC3)和P62的表达。取左心室动脉血检测心肌酶谱5项和心肌肌钙蛋白T(cTnT)的含量。对数据行单因素方差分析、t检验。

结果

(1)经鉴定,样品溶酶体相关膜蛋白1表达水平最高,溶酶体纯度高、结构完整。(2)伤后24 h,单纯烧伤组、ATP组、正常对照组、巴佛洛霉素组大鼠心肌组织溶酶体V-ATP酶活性分别为(2.03±0.67)、(3.01±0.58)、(4.29±0.26)、(1.83±0.52)μmol·mg-1·h-1。其中单纯烧伤组大鼠心肌组织溶酶体V-ATP酶活性明显低于ATP组和正常对照组(t值分别为3.14和8.87,P值均小于0.01),正常对照组大鼠心肌组织溶酶体V-ATP酶活性明显高于巴佛洛霉素组(t=11.87,P<0.01)。伤后24 h,单纯烧伤组大鼠心肌LC3和P62的表达显著高于ATP组和正常对照组(t值为3.73~5.88,P值均小于0.01),正常对照组大鼠心肌LC3和P62的表达明显低于巴佛洛霉素组(t值分别为2.64和3.07,P<0.05或P<0.01)。伤后24 h,单纯烧伤组大鼠心肌酶谱5项和cTnT含量明显高于ATP组和正常对照组(t值为3.24~16.72,P值均小于0.01),正常对照组大鼠心肌酶谱5项和cTnT含量明显低于巴佛洛霉素组(t值为2.39~10.70,P值均小于0.01)。

结论

大鼠严重烧伤后心肌组织溶酶体V-ATP酶活性下降,可通过抑制大鼠心肌自噬流引起心肌损害。

引用本文: 闫雪萍, 张东霞, 闫甜甜, 等.  大鼠严重烧伤后心肌组织溶酶体液泡型腺苷三磷酸酶活性变化对心肌损害的影响及其机制 [J]. 中华烧伤杂志,2017,33( 5 ): 295-300. DOI: 10.3760/cma.j.issn.1009-2587.2017.05.008
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严重烧伤早期心肌缺氧损害是休克和脏器并发症的重要影响因素。既往研究显示,单纯烧伤后大鼠可因休克缺氧引起心肌自噬体增多,这一系列变化是心肌损伤和功能降低的重要影响因素[1],抑制自噬体蓄积可改善烧伤后心功能障碍[2,3]。自噬包括以下步骤:诱导、囊泡的核化、自噬体成熟、自噬体与溶酶体融合、底物降解与营养再循环。上述所有自噬步骤的动态过程即为自噬流,当自噬流受损时会引起自噬体/自噬溶酶体在细胞内蓄积,并进一步导致细胞损伤[3]。研究显示,自噬流受损与多种疾病的发生有关,故笔者推测严重烧伤后心肌自噬体的过度蓄积可能与自噬流受损有关。已知溶酶体的酸化是调控自噬流的关键环节,氯化铵或氯喹可中和溶酶体的酸化,阻碍自噬体与溶酶体的融合,导致自噬流受损及自噬体累积[4]。但是,导致自噬流受损及自噬体累积的具体机制尚不清楚。在溶酶体酸化过程中,液泡型ATP(V-ATP)酶是调控溶酶体酸化的关键途径。巴佛洛霉素A1可通过抑制V-ATP酶质子泵而抑制V-ATP酶活性;而ATP处理可使V-ATP酶底物浓度增加,V-ATP酶活性显著增强。故本研究拟采用外源性巴佛洛霉素A1和ATP干预心肌组织溶酶体V-ATP酶活性,观察心肌组织溶酶体V-ATP酶、心肌自噬流及心肌损害的变化,探讨严重烧伤后心肌损害与自噬流受损之间的关系及相关机制。

1 材料与方法
1.1 动物及主要试剂与仪器来源

132只健康清洁级SD大鼠,雌雄不拘,2~3个月龄,体质量(220±20)g,购自第三军医大学实验动物中心,许可证号:SYXK-PLA-20120031。LYSISO1溶酶体分离试剂盒、ATP、兔抗小鼠微管相关蛋白1轻链3(LC3)单克隆一抗、乳酸脱氢酶/丙酮酸激酶溶液均购自美国Sigma公司,巴佛洛霉素A1购自美国Selleck Chemicals公司,RIPA裂解液购自南京凯基生物科技发展有限公司,兔抗小鼠整合素单克隆一抗、兔抗小鼠过氧化物酶体增殖物激活受体α单克隆一抗、兔抗小鼠过氧化氢酶单克隆一抗、兔抗小鼠溶酶体相关膜蛋白1(LAMP1)单克隆一抗、叶霉素均购自美国Abcam公司,辣根过氧化物酶标记的兔抗小鼠GAPDH单克隆一抗购自上海康成生物工程有限公司,兔抗小鼠线粒体电压依赖性阴离子通道蛋白1单克隆一抗、兔抗小鼠V-ATP酶单克隆一抗购自美国Santa Cruz公司,兔抗小鼠P62单克隆一抗购自美国Cell Signaling Technology公司,辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG二抗购自北京中杉金桥生物技术有限公司。超高速低温离心机购自美国Beckman公司,ChemiDoc XRS型凝胶成像仪购自美国Bio-Rad公司,Varioskan Flash型多功能酶标仪购自美国Thermo Scientific公司。

1.2 大鼠心肌组织溶酶体的提取与鉴定

取12只大鼠,麻醉后,暴露胸腔,摘取整个心脏组织。按照溶酶体分离试剂盒步骤制备心肌匀浆液,留取100 μL提取心肌组织总蛋白,4 ℃保存。余下心肌匀浆液经差速离心得粗提溶酶体(CLF),留取100 μL 4 ℃保存。余下CLF经超高速梯度密度离心后分为多层区带,从上至下分层取样依次以数字标记。将各区带样品以20 000×g离心30 min,弃上清液,留取沉淀并标记。在组织总蛋白、CLF和各区带样品中加入RIPA裂解液,于冰上充分裂解,14 000×g离心15 min,取上清液行蛋白定量。蛋白变性后行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳、半干法转膜,于50 g/L脱脂奶粉溶液中室温振荡封闭2 h。分别加兔抗小鼠整合素单克隆一抗(稀释比为1∶2 000)、兔抗小鼠过氧化物酶体增殖物激活受体α单克隆一抗(稀释比为1∶2 000)、辣根过氧化物酶标记的兔抗小鼠GAPDH单克隆一抗(稀释比为1∶5 000)、兔抗小鼠线粒体电压依赖性阴离子通道蛋白1单克隆一抗(稀释比为1∶500)、兔抗小鼠过氧化氢酶单克隆一抗(稀释比为1∶2 000)、兔抗小鼠LAMP1单克隆一抗(稀释比为1∶2 000)、兔抗小鼠V-ATP酶单克隆一抗(稀释比为1∶1 000),4 ℃孵育过夜。次日加入辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG二抗(稀释比为1∶5 000),室温孵育1 h,化学发光、显影,凝胶成像仪获取图片,观察各亚细胞组分相关蛋白表达。另取溶酶体沉淀加入1 mL电镜固定液,送第三军医大学中心实验室制作透射电镜标本后观察溶酶体纯度。

1.3 动物分组及处理

将120只大鼠按随机数字表法分为单纯烧伤组、ATP组、正常对照组、巴佛洛霉素组,每组30只。单纯烧伤组和ATP组大鼠用10 g/L戊巴比妥钠以40 mg/kg腹腔注射麻醉,背部脱毛后浸入88.8 ℃电热恒温水浴箱中35 s造成背部约40%TBSA Ⅲ度烫伤(经病理切片证实,以下称烧伤,由于大鼠背部肌肉发达,腹部皮肤较厚,耐受力强,该条件所致烧伤不会直接累及胸腹部器官)。单纯烧伤组大鼠伤后即刻根据Parkland补液公式腹腔注射乳酸林格液4 mL·%TBSA-1·kg-1,ATP组大鼠分别于伤前12 h、伤后即刻、伤后12 h腹腔注射ATP 0.4 mg/kg。正常对照组大鼠不行任何处理,巴佛洛霉素组与ATP组大鼠同时相点腹腔注射巴佛洛霉素A1 0.3 mg/kg。实验期间大鼠均正常进食饮水。

1.4 大鼠心肌组织溶酶体V-ATP酶活性、心肌自噬相关蛋白及心肌损害相关指标检测

采用酶偶联分析法检测V-ATP酶活性,蛋白质印迹法检测心肌自噬相关蛋白LC3和P62的表达,取左心室动脉血,检测心肌酶谱5项和心肌肌钙蛋白T(cTnT)含量。4组大鼠各取30只,于烧伤大鼠伤后24 h麻醉,充分暴露胸腔后于左心室抽取2 mL血液,分离血清后送笔者单位检验科检测心肌酶谱5项,包括AST、乳酸脱氢酶、α羟基丁酸脱氢酶、肌酸激酶、肌酸激酶同工酶及cTnT含量。随后剪开大鼠右心耳,采用20 mL乳酸钠林格液行心脏灌注,摘取整个心脏并称取约5 mg心肌组织加入1 mL RIPA裂解液,超声匀浆,于冰上提取组织总蛋白并定量。蛋白变性后行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳、半干法转膜,于50 g/L脱脂奶粉溶液中室温振荡封闭2 h。加入兔抗小鼠LC3单克隆一抗(稀释比为1∶5 000)、兔抗小鼠P62单克隆一抗(稀释比为1∶1 000)、辣根过氧化物酶标记的兔抗小鼠GAPDH单克隆一抗(稀释比为1∶5 000),4 ℃孵育过夜。次日加入辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG二抗(稀释比为1∶5 000),室温孵育1 h,化学发光、显影,凝胶成像仪行灰度扫描分析,结果以目的蛋白与GAPDH灰度值比值表示。余下心肌组织按溶酶体分离试剂盒步骤提取溶酶体后,取96孔板,于2孔中同时分别加入93 μL反应缓冲液和腺苷三磷酸氯化镁溶液的混合液、2 μL乳酸脱氢酶/丙酮酸激酶混合液、1 μL还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸溶液、1 μL叠氮化钠溶液、1 μL磷酸烯醇式丙酮酸单钾盐溶液,其中1孔另加入1 μL叶霉素溶液,多功能酶标仪37 ℃孵育3 min后,2孔均分别加入待测溶酶体混悬液2 μL。最终的约100 μL反应体系包含125 mmol/L三羟甲基氨基甲烷缓冲液、1 mmol/L乙二醇二乙醚二胺四乙酸、12.5 mmol/L氯化钾、125 mmol/L氯化钠、0.5 mmol/L叠氮化钠溶液、2.5 mmol/L磷酸烯醇式丙酮酸单钾盐溶液、2 U乳酸脱氢酶/丙酮酸激酶混合液、0.5 mmol/L还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸、5 mmol/L腺苷三磷酸氯化镁溶液。用多功能酶标仪振荡1 s后在340 nm波长处、37 ℃条件下间隔1 s用酶标仪连续检测吸光度值15 min后,计算ATP酶活性[5]

1.5 统计学处理

数据以±s表示,采用SPSS 19.0统计软件对组间总体比较行单因素方差分析,组间两两比较行t检验,P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果
2.1 大鼠心肌组织溶酶体的鉴定

CLF分布于离心管的中下部,见图1A。经超高速梯度密度离心后的CLF分为4层浑浊区带,分别标记为1、2、3、4,见图1B。结果显示:与心肌组织总蛋白比较,CLF所含LAMP1明显增多;在区带1、2、3、4中,其所含LAMP1含量依次减少;且与CLF比较,区带1中LAMP1含量明显上升,说明区带1所含LAMP1最多,且其所含LAMP1以外成分含量较少,见图2。进一步对区带1行透射电镜检测,整个视野全为溶酶体,几乎不含线粒体等其他杂质,且溶酶体结构较完整。见图3

图1
健康大鼠心肌组织溶酶体在梯度密度介质中的分布。1A.心肌组织经差速离心所得粗提溶酶体(CLF)的分布;1B.CLF经超高速梯度密度离心后的分布

注:图1B中1、2、3、4指区带1、2、3、4

图1
健康大鼠心肌组织溶酶体在梯度密度介质中的分布。1A.心肌组织经差速离心所得粗提溶酶体(CLF)的分布;1B.CLF经超高速梯度密度离心后的分布
图2
蛋白质印迹法检测健康大鼠心肌组织各亚细胞组分相关蛋白表达

注:1.心肌组织总蛋白,2.粗提溶酶体,3~6分别为区带1~4

图2
蛋白质印迹法检测健康大鼠心肌组织各亚细胞组分相关蛋白表达
图3
健康大鼠心肌组织样品区带1整个视野全为溶酶体,几乎不含线粒体等其他杂质 透射电镜×15 000,图中标尺为2 μm
图3
健康大鼠心肌组织样品区带1整个视野全为溶酶体,几乎不含线粒体等其他杂质 透射电镜×15 000,图中标尺为2 μm
2.2 大鼠心肌组织溶酶体V-ATP酶活性、心肌自噬相关蛋白及心肌损害相关指标

伤后24 h,单纯烧伤组、ATP组、正常对照组、巴佛洛霉素组大鼠心肌组织溶酶体V-ATP酶活性分别为(2.03±0.67)、(3.01±0.58)、(4.29±0.26)、(1.83±0.52)μmol·mg-1·h-1,组间总体比较差异明显(F=35.75,P<0.01)。其中单纯烧伤组大鼠心肌组织溶酶体V-ATP酶活性明显低于ATP组和正常对照组(t值分别为3.14和8.87,P值均小于0.01),正常对照组大鼠心肌组织溶酶体V-ATP酶活性明显高于巴佛洛霉素组(t=11.87,P<0.01)。伤后24 h,单纯烧伤组大鼠心肌LC3和P62表达显著高于ATP组和正常对照组(P值均小于0.01),正常对照组大鼠心肌LC3和P62表达明显低于巴佛洛霉素组(P<0.05或P<0.01)。见表1图4。伤后24 h,单纯烧伤组大鼠心肌酶谱5项和cTnT含量明显高于ATP组和正常对照组(P值均小于0.01),正常对照组大鼠心肌酶谱5项和cTnT含量明显低于巴佛洛霉素组(P值均小于0.01)。见表2

表1

4组大鼠伤后24 h心肌组织自噬相关蛋白微管相关蛋白1轻链3和P62的表达比较(±s)

表1

4组大鼠伤后24 h心肌组织自噬相关蛋白微管相关蛋白1轻链3和P62的表达比较(±s)

组别鼠数(只)微管相关蛋白1轻链3P62
单纯烧伤组300.46±0.080.138±0.009
ATP组300.33±0.030.104±0.014
正常对照组300.29±0.050.107±0.219
巴佛洛霉素组300.36±0.060.132±0.006
F 14.0812.07
P <0.01<0.01
t1 4.585.88
P1 <0.01<0.01
t2 5.563.73
P2 <0.01<0.01
t3 2.643.07
P3 0.02<0.01

注:F值、P值为组间总体比较所得;t1值、P1值为单纯烧伤组与ATP组比较所得;t2值、P2值为单纯烧伤组与正常对照组比较所得;t3值、P3值为正常对照组与巴佛洛霉素组比较所得

表2

4组大鼠伤后24 h心肌酶谱5项和心肌肌钙蛋白T含量比较(±s)

表2

4组大鼠伤后24 h心肌酶谱5项和心肌肌钙蛋白T含量比较(±s)

组别鼠数(只)AST(U/L)乳酸脱氢酶(U/L)α羟基丁酸脱氢酶(U/L)肌酸激酶(U/L)肌酸激酶同工酶(U/L)心肌肌钙蛋白T(μg/L)
单纯烧伤组301 638±2591 810±589910±28610 607±4 869932±1326.5±1.7
ATP组301 105±281834±223543±1463 333±1 649345±842.3±0.5
正常对照组30107±13399±113162±25399±75525±1921.9±1.1
巴佛洛霉素组30278±43774±189312±111568±80762±2056.0±2.7
F 111.7026.0229.2727.6619.5316.40
P <0.01<0.01<0.01<0.01<0.01<0.01
t1 3.954.383.244.009.546.84
P1 <0.01<0.01<0.01<0.01<0.01<0.01
t2 16.726.657.375.934.706.47
P2 <0.01<0.01<0.01<0.01<0.01<0.01
t3 10.704.823.724.342.394.02
P3 <0.01<0.01<0.01<0.01<0.01<0.01

注:F值、P值为组间总体比较所得;t1值、P1值为单纯烧伤组与ATP组比较所得;t2值、P2值为单纯烧伤组与正常对照组比较所得;t3值、P3值为正常对照组与巴佛洛霉素组比较所得

图4
蛋白质印迹法检测伤后24 h 4组大鼠心肌组织自噬相关蛋白LC3和P62的表达

注:LC3为微管相关蛋白1轻链3;1.正常对照组,2.巴佛洛霉素组,3.单纯烧伤组,4.ATP组

图4
蛋白质印迹法检测伤后24 h 4组大鼠心肌组织自噬相关蛋白LC3和P62的表达
3 讨论

笔者团队以往的系列研究和国内外文献均证明,严重烧伤早期可迅即发生心肌损伤。心脏作为循环动力器官,早期严重的损伤不仅引起心功能不全,还将进一步减少机体氧供,加重全身其他组织器官缺血缺氧损伤,增加严重烧伤休克病死率与总体病死率[1,6]

cTn是心肌肌肉收缩的调节蛋白。5%~8%的cTnT分布于心肌细胞细胞质,为游离的细胞质蛋白;92%~95%的cTnT结合于细肌丝中,为结合的结构蛋白。当心肌细胞因缺血缺氧等因素遭受破坏时,游离型cTnT可首先迅速从细胞中释放入血,随后结合于心肌结构蛋白中的结合型cTnT逐渐分解,缓慢释放入循环血中。而心肌酶谱主要是确定心肌缺血坏死或细胞膜通透性的。二者结合可很好地检测心肌损伤情况。

烧伤等应激可损伤细胞自噬流,并进一步促进、放大凋亡和坏死等病理损害。研究显示,缺血-再灌注使心肌出现自噬体清除障碍,即自噬流受损,且体外研究证实自噬流受损引起的自噬体蓄积可进一步导致心肌细胞死亡[7],但自噬流受损的确切机制尚不清楚。而LC3、P62是参与自噬流的2种主要蛋白。在自噬相关蛋白4作用下,LC3前体被加工成可溶性LC3-Ⅰ,后者在自噬相关蛋白7和自噬相关蛋白3作用下与磷脂酰乙醇胺(PE)连接成为脂溶性的LC3-Ⅱ-PE,参与自噬溶酶体膜的延伸,直到自噬溶酶体形成[8,9]。定位于细胞质中的P62与经泛素化的蛋白结合,P62再与LC3-Ⅱ结合形成复合物,并最终会在溶酶体内降解,在自噬的过程中,P62会不断被消耗[9,10]。因此,LC3、P62是自噬流受损的标志蛋白。

导致心肌自噬流受损的机制尚不完全清楚,在溶酶体酸化过程中,V-ATP酶是一种对pH值敏感的质子转运蛋白,通过不可逆地水解,ATP驱动细胞质内的氢离子进入溶酶体,使其酸化,进而介导自噬体与溶酶体融合、激活溶酶体酶并促进底物降解。当溶酶体V-ATP酶活性下降后,势必影响其对细胞质中氢离子的转运能力,影响溶酶体的酸化,从而损伤自噬流。严重烧伤是否通过溶酶体V-ATP酶活性改变导致心肌自噬流受损,尚鲜见文献报道。

既往检测ATP酶活性时使用的方法是Fiske建立的钼蓝比色法,Itaya和Ui[11]研究显示,磷酸钼与孔雀石绿生成的复合物有很高的克分子消光系数,可用于灵敏测定无机磷。但用于ATP酶分析时,酸性钼酸催化的底物ATP非酶促水解,严重干扰对酶活性的测定,经过改进后,该检测方法的灵敏度仍较低。故在提纯溶酶体后,本研究采用酶偶联分析法检测V-ATP酶活性,在本检测法中,底物ATP受到心肌组织溶酶体中的V-ATP酶的水解,通过偶联丙酮酸激酶和乳酸脱氢酶的反应,测定还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸在340 nm波长处特征吸收光谱的变化计算出ATP的水解量,以此定量分析V-ATP酶的特异活性。且检测酶活性时,酶偶联分析法不需要制作无机磷的标准曲线,操作简单、结果可靠。

巴佛洛霉素A1是一种可酸化自噬体内囊泡物质的V-ATP酶质子泵抑制剂,可通过降低V-ATP酶活性而抑制溶酶体酸化,进而影响自噬体后期形成[12]。ATP是V-ATP酶底物,可显著提高其活性,进而促进溶酶体酸化,使自噬流更加通畅。本研究显示,与正常对照组大鼠比较,单纯烧伤组大鼠严重烧伤后,心肌组织溶酶体V-ATP酶活性下降、心肌自噬相关蛋白LC3、P62的表达增加、cTnT和心肌酶谱各指标含量均明显增高,说明严重烧伤可导致心肌组织溶酶体V-ATP酶活性减弱、自噬流障碍及心肌受损。巴佛洛霉素组大鼠较正常对照组大鼠V-ATP酶活性降低、心肌自噬相关蛋白LC3、P62的表达增加、cTnT和心肌酶谱各指标含量均明显增高;与单纯烧伤组大鼠比较,ATP组大鼠V-ATP酶活性增加,心肌自噬相关蛋白LC3、P62表达减少,cTnT和心肌酶谱各指标含量均明显下降。提示V-ATP酶活性与自噬流和心肌损害密切相关,抑制其活性会阻断自噬流,心肌损害显著,激活其活性可使自噬流通畅,心肌损害明显改善;自噬流受损程度与心肌损害亦密切相关,自噬流障碍可导致心肌受损,改善自噬流后心肌损害可明显好转,说明严重烧伤后V-ATP酶活性下降所导致的自噬流受损是引起心肌损害的重要原因。

综上所述,严重烧伤可通过抑制大鼠心肌组织溶酶体V-ATP酶活性使心脏自噬流受损,从而导致心肌损害。提高V-ATP酶活性可减轻严重烧伤心肌缺血缺氧损害,对减少并发症、提高烧伤救治水平提供了新的治疗靶点。

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关键词
主题词
烧伤
心肌
自噬
溶酶体
液泡型腺苷三磷酸酶