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论著
缺氧诱导因子1α对P311的作用及其对小鼠表皮干细胞迁移的影响
中华烧伤杂志, 2017,33(05): 287-294. DOI: 10.3760/cma.j.issn.1009-2587.2017.05.007
摘要
目的

体外条件下模拟缺氧环境,探讨P311和缺氧诱导因子1α(HIF-1α)相互作用及对小鼠表皮干细胞(ESC)迁移影响。

方法

取15只C57BL/6J野生型新生小鼠,5只同属来源P311基因敲除新生小鼠,分离培养2种小鼠ESC,取第1代细胞行形态学观察,采用流式细胞仪检测细胞表面标志物CD71、CD49f表达后行以下实验。(1)取2种小鼠ESC划痕处理后,立即按随机数字表法(下同)将P311基因敲除小鼠ESC分为常氧组(将细胞加入完全培养基置于常氧二氧化碳培养箱培养,常氧处理下同)和缺氧组(将细胞置于含体积分数1%氧气的缺氧二氧化碳培养箱培养,缺氧处理下同),每组12个插件;将野生型小鼠ESC分为常氧组、单纯缺氧组、二甲基亚砜(DMSO)对照组(用2 μL DMSO溶剂常氧处理1 h后行缺氧培养)、HIF-1α抑制剂组(加入11 μmol/L HIF-1抑制剂2 μL常氧培养1 h后行缺氧培养)、HIF-1α稳定剂组(加入2 μmol/L FG-4592 2 μL常氧处理1 h后行缺氧培养),每组12个插件。每组各时相点取3个插件分别于划痕后0(即刻)、12 、24、48 h在100倍倒置相差显微镜下测量划痕剩余宽度。(2)取野生型小鼠ESC行缺氧培养,蛋白质印迹法检测缺氧0(即刻)、12、24、48 h HIF-1α蛋白表达。(3)取野生型小鼠ESC同实验(1)分为单纯缺氧组、DMSO对照组、HIF-1α抑制剂组、HIF-1α稳定剂组并行相应处理,分别在缺氧0、12、24、48 h采用实时荧光定量RT-PCR法检测P311 mRNA表达,免疫细胞化学染色法观测P311表达(样本数均为12)。(4)取第2代人胚胎肾293(HEK-293)细胞分为空载缺氧组(转染空载质粒后进行缺氧培养)、P311常氧组(转染P311报告基因质粒后进行常氧培养)、P311缺氧组(转染P311报告基因质粒后进行缺氧培养)、P311缺氧+HIF-1α抑制剂组(HIF-1抑制剂处理后转染P311报告基因质粒然后进行缺氧培养),分别于培养0、12 h检测荧光素酶活性,采用生物信息学方法预测HIF-1α对P311转录调节的结合位点并查找P311启动子序列。对数据行析因设计方差分析、单因素方差分析、LSD检验以及Bonferroni校正。

结果

(1)ESC结果。细胞呈现铺路石样改变,细胞由于增殖潜能不同而呈现不同克隆状态。CD71CD49f细胞占85%左右,说明ESC的干性较强、纯度较高。与P311基因敲除小鼠常氧组比较,单纯缺氧组细胞划痕后12、24 h划痕剩余宽度较小(P值均小于0.05),缺氧组、野生型小鼠常氧组、DMSO对照组、HIF-1α抑制组、HIF-1α稳定剂组细胞划痕后12 h划痕剩余宽度较小(P值均小于0.05)。与野生型小鼠常氧组比较,缺氧组、单纯缺氧组、DMSO对照组细胞划痕后12、24 h划痕剩余宽度较小(P值均小于0.05),HIF-1α稳定剂组细胞划痕后12 h划痕剩余宽度较小(P<0.05)。与单纯缺氧组比较,缺氧组细胞划痕后12、24 h划痕剩余宽度较大(P值均小于0.05),HIF-1α抑制剂组细胞划痕后12 h划痕剩余宽度较大(P<0.05),HIF-1α稳定剂组细胞划痕后12、24 h划痕剩余宽度较小(P值均小于0.05)。7组小鼠细胞间划痕后48 h划痕剩余宽度总体比较差异不明显(F=19.02,P>0.05)。野生型小鼠ESC缺氧0、12、24、48 h的HIF-1α蛋白表达量分别为1.02±0.05、2.56±0.09、1.60±0.17、1.17±0.03。与缺氧0 h比较,HIF-1α蛋白表达量缺氧12 h明显增加(P<0.01),缺氧24 h开始下降但仍高于缺氧0 h(P<0.05),缺氧48 h后降至常氧水平(P>0.05)。与单纯缺氧组比较,HIF-1α抑制剂组细胞缺氧各时相点P311 mRNA表达量均明显下降(P值均小于0.05),HIF-1α稳定剂组细胞P311 mRNA表达量则在缺氧12、24 h明显升高(P值均小于0.05)。与HIF-1α抑制剂组比较,DMSO对照组和HIF-1α稳定剂组细胞在缺氧0、12、24 h P311 mRNA表达量均明显升高(P值均小于0.05)。与单纯缺氧组比较,HIF-1α抑制剂组细胞缺氧各时相点P311表达量均明显下降(P值均小于0.05),而HIF-1α稳定剂组细胞P311表达量则在缺氧12、24 h明显升高(P值均小于0.05)。与HIF-1α抑制剂组比较,DMSO对照组和HIF-1α稳定剂组细胞P311表达量在缺氧12、24 h明显升高(P值均小于0.05)。(2)HEK-293细胞结果。培养0 h,空载缺氧组、P311常氧组、P311缺氧组、P311缺氧+HIF-1α抑制剂组细胞荧光素酶活性差异无统计学意义(F=13.33,P>0.05)。培养12 h,P311缺氧组细胞荧光素酶活性较空载缺氧组高(P<0.01);P311缺氧组细胞荧光素酶活性较P311常氧组高(P<0.05);P311缺氧+HIF-1α抑制剂组细胞荧光素酶活性较P311缺氧组低(P<0.01)。

结论

缺氧早期,HIF-1α可能通过诱导P311表达促进小鼠ESC迁移。

引用本文: 徐正东, 李海胜, 王淞, 等.  缺氧诱导因子1α对P311的作用及其对小鼠表皮干细胞迁移的影响 [J]. 中华烧伤杂志,2017,33( 5 ): 287-294. DOI: 10.3760/cma.j.issn.1009-2587.2017.05.007
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皮肤完整性是机体抵御环境损害的重要物质基础之一,快速修复受损的皮肤创面仍是烧伤治疗面临的最主要任务[1]。表皮干细胞(ESC)脱黏附离巢后才具有迁移能力,并最终通过再上皮化修复创面[2],故ESC脱黏附离巢是启动包括烧伤创面在内的皮肤创面自行愈合的关键步骤。笔者课题组在之前的研究中观察到,P311能够促进ESC迁移,并在小鼠浅Ⅱ度烧伤创面愈合中起作用[3]。大量研究表明,P311参与多种受损组织的修复[4,5]。但迄今仍未完全清楚P311的生物学功能,也没能将其归入任何一类已知蛋白家族。正常皮肤组织中并无P311表达,但从烧伤后第2天开始,在皮肤基底层、毛囊等处ESC中可见P311大量表达。烧伤后是什么原因引起P311表达的尚不清楚。缺血/缺氧是创面及创周重要的生物学事件,根据文献及笔者前期工作基础,笔者推测,缺氧可能是引起烧伤创面P311表达的重要因素之一[6]。已有大量研究表明缺氧诱导因子1α(HIF-1α)是缺氧环境下核心转录因子,其高表达后激活下游基因,是启动缺氧条件下包括细胞迁移在内的多种生物学行为的重要始动因子。本研究旨在通过体外条件下模拟烧伤缺氧环境,探究HIF-1α对P311的作用及对小鼠ESC迁移的影响。

1 材料与方法
1.1 动物、主要试剂及仪器来源

15只无特殊病原体级C57BL/6J野生型小鼠,雌雄不拘,1~3 d龄,体质量0.5~1.5 g,购自第三军医大学实验动物研究所,许可证号:SCXK(渝)2012-0005;5只同属来源P311基因敲除小鼠,雌雄不拘,1~3 d龄,体质量0.5~1.5 g,购自第三军医大学大坪医院实验动物中心,许可证号:SYXK(渝)2012-0010。5 g/L中性蛋白酶Ⅱ、2.5 g/L胰蛋白酶、丝裂霉素C粉末、KC无血清培养基(K-SFM)购自美国Sigma公司,霍乱毒素购自中科迈晨(北京)科技有限公司,小鼠来源CD71、CD49f单克隆抗体均购自美国BD公司,二甲基亚砜(DMSO)购自重庆市华雅干细胞技术有限公司,磷酸化蛋白提取试剂盒(简易型)购自江苏凯基生物技术股份有限公司,HIF-1稳定剂FG-4592购自美国MedChemExpress公司,HIF-1抑制剂2ME2及小鼠来源Ⅳ型胶原蛋白购自圣克鲁斯(上海)生物技术公司,小鼠来源HIF-1α单克隆抗体及兔抗小鼠β微管蛋白多克隆一抗购自美国Abcam公司,兔抗小鼠P311多克隆一抗购自美国NOVUS公司,山羊抗兔IgG多克隆二抗及兔抗小鼠IgG多克隆二抗购自天津三箭生物技术有限公司,生物素-链霉亲和素-过氧化物酶(SP)法免疫组织化学试剂盒、二氨基联苯胺(DAB)显色试剂盒均购自武汉博士德生物工程有限公司,人胚胎肾293(HEK-293)细胞株购自重庆金麦生物技术有限公司,划痕试验专用细胞培养插件购自德国ibidi公司,脂质体2000购自美国Thermo公司、pGL3报告质粒、荧光素酶报告基因检测试剂盒购自美国Promega公司。IX71型倒置相差显微镜购自日本Olympus公司,紫外分光光度计、常氧及缺氧二氧化碳培养箱购自美国Thermo公司,凝胶成像仪购自美国Promega公司,实时荧光定量PCR仪购自德国Eppendorf公司。

1.2 ESC的分离、培养及鉴定

取15只野生型小鼠、5只P311基因敲除小鼠,乙醚麻醉后,颈椎脱臼处死。完整分离皮肤组织,5 g/L中性蛋白酶Ⅱ溶液4 ℃孵育8 h。分离表皮并剪碎,2.5 g/L胰蛋白酶常温孵育8 min,含血清1640培养基终止消化,过滤离心后加入完全培养基(由K-SFM 500 mL、20~30 μg/mL牛垂体提取物、10 ng/mL小鼠EGF、0.02 mmol/L氯化钙、100 U/mL青霉素、100 U/mL链霉素、1×10-10 mol/L霍乱毒素混合所得)重新悬浮。将细胞接种于Ⅳ型胶原蛋白包被的培养皿中,37 ℃静置15 min。弃去未贴壁细胞,换完全培养基,置入37 ℃、体积分数为5%的二氧化碳常氧培养箱培养,隔日更换培养基,定时观察细胞生长状况[3,7]。待细胞生长至60%~70%融合时进行传代培养,取第1代细胞,采用200倍倒置相差显微镜行形态学观察并用流式细胞仪检测细胞表面标志物CD71、CD49f表达[8]后进行后续实验。

1.3 划痕试验检测ESC迁移能力

取野生型及P311基因敲除小鼠ESC,以密度为8×104个/cm2接种至0.22 cm2大小划痕试验专用培养插件中,待细胞生长至约70%融合时,首先用终质量浓度为5 μg/mL的丝裂霉素C常氧处理2 h抑制其增殖[9],然后用无菌镊移除划痕试验专用培养插件中间的嵌套,形成宽度约800 μm单层细胞创伤模型(即划痕处理)。划痕后即刻采用随机数字表法(下同)将P311基因敲除小鼠ESC分为常氧组(将细胞加入完全培养基置于常氧体积分数5%二氧化碳培养箱培养,常氧处理下同)和缺氧组(将细胞置于含体积分数1%氧气的缺氧体积分数5%二氧化碳培养箱培养,缺氧处理下同),每组12个插件;将野生型小鼠ESC分为常氧组、单纯缺氧组、DMSO对照组(用2 μL DMSO溶剂常氧处理1 h后行缺氧培养)、HIF-1α抑制剂组(加入11 μmol/L HIF-1抑制剂2 μL常氧培养1 h后行缺氧培养)、HIF-1α稳定剂组(加入2 μmol/L FG-4592 2 μL常氧处理1 h后行缺氧培养[10]),每组12个插件。分别于划痕后0(即刻)、12、24、48 h,每组各时相点取3个插件在100倍倒置相差显微镜下观察并测量划痕剩余宽度[3,7]。剩余宽度越大,迁移速度越小。

1.4 蛋白质印迹法检测野生型小鼠ESC HIF-1α蛋白表达

按照8×104个/cm2的密度将野生型小鼠ESC接种至直径为35 mm的培养皿中,行缺氧培养。分别于缺氧0(即刻)、12、24、48 h,每个时相点取3皿细胞采用磷酸化蛋白提取试剂盒提取总蛋白,取25 μg进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳,湿法转膜,体积分数为3%的牛血清白蛋白封闭2 h。加入小鼠来源HIF-1α单克隆抗体(稀释比为1∶5 000)和兔抗小鼠β微管蛋白多克隆一抗(稀释比为1∶2 000),4 ℃培养过夜。Tris-吐温20缓冲液(TBST)洗涤5次,每次5 min,加入兔抗小鼠IgG多克隆二抗(稀释比为1∶5 000),室温孵育1.5 h,TBST洗涤5次。化学发光剂发光,凝胶成像仪采集图像,Quantity One图像分析软件(美国Bio-Rad公司)进行灰度分析,目的蛋白表达量以目的蛋白与内参照β微管蛋白灰度值比值表示[11]

1.5 实时荧光定量RT-PCR法检测野生型小鼠ESC中P311 mRNA表达

取野生型小鼠ESC同1.3接种至培养皿并分为单纯缺氧组、HIF-1α抑制剂组、HIF-1α稳定剂组、DMSO对照组行相应处理。各组分别在缺氧0、12、24、48 h后取3皿细胞采用Trizol法提取细胞总RNA,紫外分光光度计检测RNA浓度及纯度。取2 μg RNA利用无RNA酶水将其稀释,按照40 μL反应体系反转录成互补DNA,反转录产物采用实时荧光定量PCR仪检测P311 mRNA表达。引物自行设计并送生工生物工程(上海)股份有限公司合成,P311上游引物为5′-TCCACACAGCTTGTTTCAGC-3,下游引物为5′-ATGGGCCCAGATAATGTTCA-3′,长度180 bp;GAPDH上游引物为5′-TTTTGTCTACGGGACGAGGC-3,下游引物为5′-CCCTCCCCCTATCAG-TTCGGA-3′,长度124 bp。反应条件为:95 ℃预变性2 min;95 ℃变性15 s,60 ℃退火15 s,72 ℃延伸32 s[12,13],共45个循环。以GAPDH作为内参照,采用Δ循环阈值(Ct)法处理结果,计算P311的mRNA相对表达量,即2-ΔΔCt

1.6 免疫细胞化学染色法观测野生型小鼠ESC中P311表达

取野生型小鼠ESC按照8×104个/cm2接种至20 mm×20 mm细胞爬片上,同1.5分组及处理。各组分别于缺氧0、12、24、48 h取3个爬片采用40 g/L多聚甲醛固定30 min,用0.25%Triton X-100对细胞进行透化处理,体积分数3%过氧化氢-甲醇液中浸泡10 min,消除内源性过氧化氢酶作用,体积分数3%牛血清白蛋白封闭30 min。加入兔抗小鼠P311多克隆一抗(稀释比为1∶500),4 ℃培养过夜,加入山羊抗兔IgG多克隆二抗(稀释比为1∶5 000),室温孵育1 h,SP工作液37 ℃孵育30 min,DAB显色液显色,苏木素复染,梯度乙醇脱水。将PBS代替一抗作为空白对照,封片剂封片,200倍光学显微镜下观察各组P311表达(棕色颗粒为阳性表达)[14]。每张切片选5个视野拍照,图片导入Image Pro Plus 6.0图像分析软件进行分析,结果以积分吸光度值表示[15,16]

1.7 荧光素酶报告基因实验检测HEK-293细胞中荧光素酶活性

利用KOD-plus高保真酶对P311启动子序列进行PCR扩增,pGL3基本载体以及TA克隆载体(PTA-P311)经KpnⅠ+NheⅠ双酶切后,回收酶切产物,T4连接酶连接,转化、提取质粒,将新重组的2个载体经KpnⅠ+NheⅠ双酶切鉴定。取第2代HEK-293细胞,待细胞生长达约90%融合时,根据质粒转染操作指南及荧光素酶报告基因检测试剂盒进行操作,将细胞分为空载缺氧组(转染空载质粒后进行缺氧培养)、P311常氧组(转染P311报告基因质粒后进行常氧培养)、P311缺氧组(转染P311报告基因质粒后进行缺氧培养)、P311缺氧+HIF-1α抑制剂组(HIF-1抑制剂处理后转染P311报告基因质粒后进行缺氧培养)。分别于培养0、12 h,采用细胞裂解液裂解细胞后行荧光素酶活性检测,通过荧光素酶活性进行启动子活性分析[17]

1.8 HIF-1α下游调节基因结合位点预测

采用生物信息学方法,登录日本自动软件平台及体系结构网站[18]预测HIF-1α对P311转录调节的结合位点;并在美国国立生物技术信息中心网站查找P311启动子序列。

1.9 统计学处理

计量资料以±s表示,采用SPSS 18.0统计软件进行处理,组间总体比较行析因设计方差分析、单因素方差分析,组间两两比较行LSD检验(软件自动略去该统计量值)并行Bonferroni校正,P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果
2.1 ESC的培养及鉴定

2种细胞均呈现铺路石样改变,单个细胞体积较小,呈规则多边形,由于细胞增殖潜能的不同而呈现出不同的克隆形态,见图1。流式细胞仪检测结果显示,CD71CD49f细胞占85%左右,说明ESC的干性较强,纯度较高,可用于后续实验。

图1
第1代野生型新生小鼠表皮干细胞呈现不同克隆形态,全息克隆状态(→)细胞体积小,部分克隆状态(→)细胞体积相对较大,次全克隆状态(→)细胞形态相对不规则,终末分化状态(→)细胞扁平化 倒置相差显微镜×200
图1
第1代野生型新生小鼠表皮干细胞呈现不同克隆形态,全息克隆状态(→)细胞体积小,部分克隆状态(→)细胞体积相对较大,次全克隆状态(→)细胞形态相对不规则,终末分化状态(→)细胞扁平化 倒置相差显微镜×200
2.2 ESC迁移能力

与P311基因敲除小鼠常氧组比较,单纯缺氧组细胞划痕后12、24 h划痕剩余宽度较小(P值均小于0.05),缺氧组、野生型小鼠常氧组、DMSO对照组、HIF-1α抑制剂组、HIF-1α稳定剂组细胞划痕后12 h划痕剩余宽度较小(P值均小于0.05)。与野生型小鼠常氧组比较,缺氧组、单纯缺氧组、DMSO对照组细胞划痕后12、24 h划痕剩余宽度较小(P值均小于0.05),HIF-1α稳定剂组细胞划痕后12 h划痕剩余宽度较小(P<0.05)。与单纯缺氧组比较,缺氧组细胞划痕后12、24 h划痕剩余宽度较大(P值均小于0.05),HIF-1α抑制剂组细胞划痕后12 h划痕剩余宽度较大(P<0.05),HIF-1α稳定剂组细胞划痕后12、24 h划痕剩余宽度较小(P值均小于0.05)。7组小鼠细胞间划痕后48 h划痕剩余宽度总体比较差异不明显(P>0.05)。见表1

表1

2种表皮干细胞各时相点划痕剩余宽度(μm,±s)

表1

2种表皮干细胞各时相点划痕剩余宽度(μm,±s)

细胞类型与组别样本数划痕后12 h划痕后24 h划痕后48 h
P311基因敲除小鼠细胞    
 常氧组12487.0±22.5235.4±12.6165.0±16.4
 缺氧组12269.3±30.3abc98.6±6.2bc0
野生型小鼠细胞    
 常氧组12466.0±20.5a205.4±12.0150.2±1.4
 单纯缺氧组12160.4±8.4ab20.4±2.4ab0
 二甲基亚砜对照组12155.3±12.4ab22.2±9.3b4.2±0.3
 HIF-1α抑制剂组12471.3±23.9ac308.2±12.6165.3±8.6
 HIF-1α稳定剂组12108.2±11.2abc3.3±2.2c0
F 23.4622.1819.02
P 0.020.040.06

注:HIF-1α为缺氧诱导因子1α;各组划痕后0 h宽度均为(798.2±7.6)μm;F值、P值为组间各时相点总体比较所得;处理因素主效应,F=6.88,P<0.05;时间因素主效应,F=28.61,P<0.05;两者交互作用,F=20.38,P<0.05;与P311基因敲除小鼠常氧组比较,aP<0.05;与野生型小鼠常氧组比较,bP<0.05;与单纯缺氧组比较,cP<0.05

2.3 野生型小鼠ESC HIF-1α蛋白表达

野生型小鼠细胞缺氧0、12、24、48 h的HIF-1α蛋白表达量分别为1.02±0.05、2.56±0.09、1.60± 0.17、1.17±0.03,总体比较差异明显(F=48.30,P<0.05)。与缺氧0 h比较,HIF-1α蛋白表达量缺氧12 h明显增加(P<0.01),缺氧24 h开始下降但仍高于缺氧0 h(P<0.05),缺氧48 h后降至常氧水平(P>0.05)。见图2

图2
蛋白质印迹法检测野生型小鼠表皮干细胞缺氧各时相点HIF-1α的蛋白表达

注:HIF-1α为缺氧诱导因子1α;1~4分别为缺氧0、12、24、48 h

图2
蛋白质印迹法检测野生型小鼠表皮干细胞缺氧各时相点HIF-1α的蛋白表达
2.4 野生型小鼠ESC中P311 mRNA表达

与单纯缺氧组比较,HIF-1α抑制剂组细胞缺氧各时相点P311 mRNA表达量均明显下降(P值均小于0.05),HIF-1α稳定剂组细胞P311 mRNA表达量则在缺氧12、24 h明显升高(P值均小于0.05)。与HIF-1α抑制剂组比较,DMSO对照组和HIF-1α稳定剂组细胞P311 mRNA表达量在缺氧0、12、24 h均明显升高(P值均小于0.05)。见表2

表2

野生型小鼠表皮干细胞各时相点P311 mRNA表达(±s)

表2

野生型小鼠表皮干细胞各时相点P311 mRNA表达(±s)

组别样本数缺氧0 h缺氧12 h缺氧24 h缺氧48 h
单纯缺氧组120.223±0.0541.099±0.0110.602±0.1160.202±0.089
二甲基亚砜对照组120.221±0.072a1.010±0.042a0.583±0.112a0.243±0.096
HIF-1α抑制剂组120.125±0.099b0.211±0.063b0.185±0.101b0.110±0.094b
HIF-1α稳定剂组120.392±0.026a1.810±0.129ab0.996±0.085ab0.201±0.039
F 7.349.375.303.65
P 0.0430.0030.0330.025

注:HIF-1α为缺氧诱导因子1α;F值、P值为组间各时相点总体比较所得;处理因素主效应,F=1027.31,P<0.05;时间因素主效应,F=672.08,P<0.05;两者交互作用,F=109.15,P<0.05;与HIF-1α抑制剂组比较,aP<0.05;与单纯缺氧组比较,bP<0.05

2.5 野生型小鼠ESC中P311表达

与单纯缺氧组比较,HIF-1α抑制剂组细胞缺氧各时相点P311表达量均明显下降(P值均小于0.05),而HIF-1α稳定剂组P311表达量则在缺氧12、24 h明显升高(P值均小于0.05)。与HIF-1α抑制剂组比较,DMSO对照组和HIF-1α稳定剂组细胞P311表达量于缺氧12、24 h明显升高(P值均小于0.05)。见表3

表3

野生型小鼠表皮干细胞各时相点P311表达(±s)

表3

野生型小鼠表皮干细胞各时相点P311表达(±s)

组别样本数缺氧0 h缺氧12 h缺氧24 h缺氧48 h
单纯缺氧组121.091±0.0791.620±0.0381.373±0.0161.225±0.018
二甲基亚砜对照组120.981±0.0771.610±0.042b1.338±0.028b1.172±0.035
HIF-1α抑制剂组120.319±0.039a0.460±0.023a0.344±0.012a0.293±0.006a
HIF-1α稳定剂组121.251±0.0302.117±0.148ab1.676±0.041ab1.315±0.024
F 2.345.925.261.08
P 0.04<0.010.030.02

注:HIF-1α为缺氧诱导因子1α;F值、P值为组间各时相点总体比较所得;处理因素主效应,F=411.69,P<0.05;时间因素主效应,F=80.53,P<0.05;两者交互作用,F=20.38,P<0.05;与单纯缺氧组比较,aP<0.05;与HIF-1α抑制剂组比较,bP<0.05

2.6 HEK-293细胞中荧光素酶活性及结合位点预测

体外扩增P311启动子序列并经酶切鉴定成功(图3)。空载缺氧组、P311常氧组、P311缺氧组、P311缺氧+HIF-1α抑制剂组细胞培养0 h荧光素酶活性分别为0.11±0.03、0.13±0.03、0.14±0.05、0.12±0.06(F=13.33,P>0.05),培养12 h荧光素酶活性分别为0.12±0.03、1.00±0.15、3.62±0.39、0.56±0.19(F=217.76,P<0.05)。处理因素主效应,F=324.82,P<0.05;时间因素主效应,F=245.09,P<0.05;两者交互作用,F=97.03,P<0.05。培养12 h,与空载缺氧组比较,P311缺氧组细胞荧光素酶活性较高(P<0.01),P311常氧组和P311缺氧+HIF-1α抑制剂组细胞荧光素酶活性则无明显差异(P值均大于0.05);与P311常氧组比较,P311缺氧组细胞荧光素酶活性明显升高(P<0.05),P311缺氧+HIF-1α抑制剂组细胞荧光素酶活性则无明显差异(P>0.05);与P311缺氧组比较,P311缺氧+HIF-1α抑制剂组细胞荧光素酶活性明显下降(P<0.01)。P311启动子上存在核心序列为"RCGTG"的片段。

图3
P311启动子基因序列的体外扩增及双酶切鉴定,结果显示目标条带释放成功

注:M.DNA marker,1、2、3分别为空载体、P311启动子载体、P311启动子酶切载体

图3
P311启动子基因序列的体外扩增及双酶切鉴定,结果显示目标条带释放成功
3 讨论

已有研究表明,P311在促进神经组织修复、创面愈合、肿瘤血管形成、胚胎发育,维持血压平衡等方面发挥着重要作用[19,20]。而P311蛋白质分子量较小且表达极不稳定,这限制了对P311结构及功能的深入研究。

缺血/缺氧是启动各种原因所致皮肤损伤创面修复等病理过程最主要的因素之一。烧伤后,ESC脱黏附离巢、迁移、再上皮化是创面修复的重要物质基础,因此探讨缺氧环境对ESC生物学行为的影响是十分必要的。大量研究表明,缺氧条件下,绝大多数基因的表达都受HIF-1α的调节。HIF-1α基因的C末段存在着相对保守的氧依赖性降解域和2个反式转录激活域,因而常氧条件下容易受泛素-蛋白酶体等的降解而生物半衰期非常短;HIF-1α在缺氧条件下则不易降解而蓄积。HIF-1α通过CBP/p300共刺激分子转入核内并与β亚基结合调节下游基因的转录激活。缺氧环境下HIF-1α高表达于KC、Fb、肿瘤细胞中,这对于激活下游基因进而促进细胞增殖、迁移、无氧糖酵解等生物学过程至关重要。那么缺氧环境下P311在ESC中的表达及生物学行为是否也与HIF-1α调节有关,尚需进一步研究。

笔者首先进行了ESC分离、培养及鉴定,观察到第1代细胞体积较小,立体感较强,符合ESC形态特征。另目前对ESC的鉴定尚无明确统一标志物,很多实验倾向于以CD19来鉴定ESC,但CD19细胞中有很大部分细胞并不具有ESC的特性,本实验选择当前认可度较高的CD71CD49f进行鉴定[8]。本研究显示缺氧条件下2种类型细胞迁移速率均较常氧下更快,同时缺氧条件下P311基因敲除小鼠细胞较野生型小鼠迁移速率慢,说明缺氧条件下P311表达增强对促进干细胞迁移具有重要作用。另笔者通过对ESC加入HIF-1抑制剂及HIF-1稳定剂后,得出HIF-1α被抑制后缺氧条件下ESC迁移减弱,而HIF-1α稳定表达则能促进ESC迁移。

那么HIF-1α与P311之间是否存在相互作用呢?笔者通过蛋白质印迹法进行检测,得出缺氧早期(12 h)HIF-1α蛋白在ESC中表达升高;实时荧光定量RT-PCR检测显示,缺氧早期P311 mRNA表达明显升高,同时HIF-1α被抑制后P311 mRNA表达水平显著下降。说明HIF-1α可能对P311的表达有促进作用。为了进一步明确HIF-1α是否直接作用于P311来调节其表达,笔者通过构建P311启动子报告基因质粒转染HEK-293细胞,得出缺氧早期P311启动子活性明显增强;而HIF-1α被抑制后,其活性则明显下降。说明缺氧早期,HIF-1α可能对P311基因转录激活具有重要作用。

综上所述,笔者的实验结果初步表明,P311在烧伤早期表达升高对促进ESC迁移具有重要作用,且其转录激活可能依赖于烧伤早期创周低氧环境下HIF-1α的调节作用,这可为下一步进行P311相关研究作铺垫。但仍面临很多问题,如P311作为小分子蛋白且极易降解,因此很难通过蛋白质印迹法检测其表达量,荧光素酶报告基因实验尚未通过截断实验明确具体结合位点,同时由于时间关系也没能通过在体实验验证HIF-1α及P311之间的关系,后续将进一步探究二者的相互作用。

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主题词
缺氧诱导因子1
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