论著
缺氧诱导因子1α对P311的作用及其对小鼠表皮干细胞迁移的影响
中华烧伤杂志, 2017,33(5) : 287-294. DOI: 10.3760/cma.j.issn.1009-2587.2017.05.007
摘要
目的

体外条件下模拟缺氧环境,探讨P311和缺氧诱导因子1α(HIF-1α)相互作用及对小鼠表皮干细胞(ESC)迁移影响。

方法

取15只C57BL/6J野生型新生小鼠,5只同属来源P311基因敲除新生小鼠,分离培养2种小鼠ESC,取第1代细胞行形态学观察,采用流式细胞仪检测细胞表面标志物CD71、CD49f表达后行以下实验。(1)取2种小鼠ESC划痕处理后,立即按随机数字表法(下同)将P311基因敲除小鼠ESC分为常氧组(将细胞加入完全培养基置于常氧二氧化碳培养箱培养,常氧处理下同)和缺氧组(将细胞置于含体积分数1%氧气的缺氧二氧化碳培养箱培养,缺氧处理下同),每组12个插件;将野生型小鼠ESC分为常氧组、单纯缺氧组、二甲基亚砜(DMSO)对照组(用2 μL DMSO溶剂常氧处理1 h后行缺氧培养)、HIF-1α抑制剂组(加入11 μmol/L HIF-1抑制剂2 μL常氧培养1 h后行缺氧培养)、HIF-1α稳定剂组(加入2 μmol/L FG-4592 2 μL常氧处理1 h后行缺氧培养),每组12个插件。每组各时相点取3个插件分别于划痕后0(即刻)、12 、24、48 h在100倍倒置相差显微镜下测量划痕剩余宽度。(2)取野生型小鼠ESC行缺氧培养,蛋白质印迹法检测缺氧0(即刻)、12、24、48 h HIF-1α蛋白表达。(3)取野生型小鼠ESC同实验(1)分为单纯缺氧组、DMSO对照组、HIF-1α抑制剂组、HIF-1α稳定剂组并行相应处理,分别在缺氧0、12、24、48 h采用实时荧光定量RT-PCR法检测P311 mRNA表达,免疫细胞化学染色法观测P311表达(样本数均为12)。(4)取第2代人胚胎肾293(HEK-293)细胞分为空载缺氧组(转染空载质粒后进行缺氧培养)、P311常氧组(转染P311报告基因质粒后进行常氧培养)、P311缺氧组(转染P311报告基因质粒后进行缺氧培养)、P311缺氧+HIF-1α抑制剂组(HIF-1抑制剂处理后转染P311报告基因质粒然后进行缺氧培养),分别于培养0、12 h检测荧光素酶活性,采用生物信息学方法预测HIF-1α对P311转录调节的结合位点并查找P311启动子序列。对数据行析因设计方差分析、单因素方差分析、LSD检验以及Bonferroni校正。

结果

(1)ESC结果。细胞呈现铺路石样改变,细胞由于增殖潜能不同而呈现不同克隆状态。CD71CD49f细胞占85%左右,说明ESC的干性较强、纯度较高。与P311基因敲除小鼠常氧组比较,单纯缺氧组细胞划痕后12、24 h划痕剩余宽度较小(P值均小于0.05),缺氧组、野生型小鼠常氧组、DMSO对照组、HIF-1α抑制组、HIF-1α稳定剂组细胞划痕后12 h划痕剩余宽度较小(P值均小于0.05)。与野生型小鼠常氧组比较,缺氧组、单纯缺氧组、DMSO对照组细胞划痕后12、24 h划痕剩余宽度较小(P值均小于0.05),HIF-1α稳定剂组细胞划痕后12 h划痕剩余宽度较小(P<0.05)。与单纯缺氧组比较,缺氧组细胞划痕后12、24 h划痕剩余宽度较大(P值均小于0.05),HIF-1α抑制剂组细胞划痕后12 h划痕剩余宽度较大(P<0.05),HIF-1α稳定剂组细胞划痕后12、24 h划痕剩余宽度较小(P值均小于0.05)。7组小鼠细胞间划痕后48 h划痕剩余宽度总体比较差异不明显(F=19.02,P>0.05)。野生型小鼠ESC缺氧0、12、24、48 h的HIF-1α蛋白表达量分别为1.02±0.05、2.56±0.09、1.60±0.17、1.17±0.03。与缺氧0 h比较,HIF-1α蛋白表达量缺氧12 h明显增加(P<0.01),缺氧24 h开始下降但仍高于缺氧0 h(P<0.05),缺氧48 h后降至常氧水平(P>0.05)。与单纯缺氧组比较,HIF-1α抑制剂组细胞缺氧各时相点P311 mRNA表达量均明显下降(P值均小于0.05),HIF-1α稳定剂组细胞P311 mRNA表达量则在缺氧12、24 h明显升高(P值均小于0.05)。与HIF-1α抑制剂组比较,DMSO对照组和HIF-1α稳定剂组细胞在缺氧0、12、24 h P311 mRNA表达量均明显升高(P值均小于0.05)。与单纯缺氧组比较,HIF-1α抑制剂组细胞缺氧各时相点P311表达量均明显下降(P值均小于0.05),而HIF-1α稳定剂组细胞P311表达量则在缺氧12、24 h明显升高(P值均小于0.05)。与HIF-1α抑制剂组比较,DMSO对照组和HIF-1α稳定剂组细胞P311表达量在缺氧12、24 h明显升高(P值均小于0.05)。(2)HEK-293细胞结果。培养0 h,空载缺氧组、P311常氧组、P311缺氧组、P311缺氧+HIF-1α抑制剂组细胞荧光素酶活性差异无统计学意义(F=13.33,P>0.05)。培养12 h,P311缺氧组细胞荧光素酶活性较空载缺氧组高(P<0.01);P311缺氧组细胞荧光素酶活性较P311常氧组高(P<0.05);P311缺氧+HIF-1α抑制剂组细胞荧光素酶活性较P311缺氧组低(P<0.01)。

结论

缺氧早期,HIF-1α可能通过诱导P311表达促进小鼠ESC迁移。

引用本文: 徐正东, 李海胜, 王淞, 等.  缺氧诱导因子1α对P311的作用及其对小鼠表皮干细胞迁移的影响 [J]. 中华烧伤杂志,2017,33( 5 ): 287-294. DOI: 10.3760/cma.j.issn.1009-2587.2017.05.007
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皮肤完整性是机体抵御环境损害的重要物质基础之一,快速修复受损的皮肤创面仍是烧伤治疗面临的最主要任务[1]。表皮干细胞(ESC)脱黏附离巢后才具有迁移能力,并最终通过再上皮化修复创面[2],故ESC脱黏附离巢是启动包括烧伤创面在内的皮肤创面自行愈合的关键步骤。笔者课题组在之前的研究中观察到,P311能够促进ESC迁移,并在小鼠浅Ⅱ度烧伤创面愈合中起作用[3]。大量研究表明,P311参与多种受损组织的修复[4,5]。但迄今仍未完全清楚P311的生物学功能,也没能将其归入任何一类已知蛋白家族。正常皮肤组织中并无P311表达,但从烧伤后第2天开始,在皮肤基底层、毛囊等处ESC中可见P311大量表达。烧伤后是什么原因引起P311表达的尚不清楚。缺血/缺氧是创面及创周重要的生物学事件,根据文献及笔者前期工作基础,笔者推测,缺氧可能是引起烧伤创面P311表达的重要因素之一[6]。已有大量研究表明缺氧诱导因子1α(HIF-1α)是缺氧环境下核心转录因子,其高表达后激活下游基因,是启动缺氧条件下包括细胞迁移在内的多种生物学行为的重要始动因子。本研究旨在通过体外条件下模拟烧伤缺氧环境,探究HIF-1α对P311的作用及对小鼠ESC迁移的影响。

 
 
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P311
缺氧诱导因子1
伤口愈合
表皮干细胞
细胞迁移分析